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液相色谱分析ppt课件

发布时间:2019-12-31 12:20    点击次数:100次   

  液相色谱分析ppt课件_理化生_高中教育_教育专区。高效液相色谱 ? 概述 ? HPLC 理论基础 ? HPLC 主要类型 ? HPLC 仪器 ? HPLC 应用 第一节 概述 ? 高效液相色谱法:以气相色谱为基础,在经典 液相色谱实验和技术基

  高效液相色谱 ? 概述 ? HPLC 理论基础 ? HPLC 主要类型 ? HPLC 仪器 ? HPLC 应用 第一节 概述 ? 高效液相色谱法:以气相色谱为基础,在经典 液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色 谱法。 一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、特点及应用 一、HPLC与经典LC区别 主要区别:固定相差别,输液设备和检测手段。 1.经典LC:仅做为一种分离手段。 ? 柱内径1-3cm,固定相粒径100μm 且不均匀。 ? 重力加料输送流动相。 ? 柱效低(H↑,n↓)。 ? 分析周期长。 ? 无法在线.HPLC:分离和分析 ? 柱内径2-6mm,固定相粒径10μm(球形,匀浆装柱) ? 高压输送流动相。 ? 柱效高(H↓,n↑)。 ? 分析时间大大缩短。 ? 可以在线检测。 二、HPLC与GC差别 ? 相同:兼具分离和分析功能,均可以在线检测。 ? 主要差别:分析对象的差别和流动相的差别。 1.分析对象: GC: 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品; 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测;占有机物的20%。 HPLC: 溶解后能制成溶液的样品, 不受样品挥发性和热稳定性的限制。 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测;占有机物的80%。 三、HPLC的特点和应用 ? “三高” “一快” “一 广” ? 高柱效——n=104片/米,柱效高(远高于一般LC) ? 高灵敏度 ? 高选择性 ? 分析速度快 ? 应用范围广泛(可分析80%有机化合物) 第二节 基本理论 热力学理论:塔板理论——平衡理论基础 动力学理论:速率理论——Vander方程 一、塔板理论 n?1( 6 tR) 2或 n?5.5(4tR )2 W W 1/2 nef f?5.5(4W t1 R ,/2)2?1(6W tR , )2 二 速率理论 ? GC: H=A+B/U+CU(填充柱) H=B/U+CU(毛细管柱) HPLC: H=A+CU B=2γD,对于HPLC,因Dm较小, B项可忽略 三、HPLC法中分离条件的选 1. 固定相与装柱方法的择选择: 选粒径小的、分布均匀的球形固定(dp≤10μm)。 首选化学键合相,匀浆法装柱。 2. 流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相。 3. 柱温的选择: 选室温250C左右 第三节 高效液相色谱仪 液相色谱仪: ?高压输液系统 ?进样系统 ?分离系统 ?检测系统 ?记录系统 工作过程图 仪器构造图 1高压输液系统 ? 高压泵 对泵的要求:输出压力高、流量范围大、流量恒定、 无脉动,流量精度和重复性为0.5%左右。还应耐腐蚀, 密封性好。 恒流泵是能给出恒定流量的泵,其流量与流动相粘度 和柱渗透无关。可迅速获得高压,适于柱的匀浆填充。 但因泵腔体积大,在往复推动时,会引起脉动,且输出 流量随色谱系统阻力(主要是柱填充物)变化而变化, 现已较少使用。 恒压泵是保持输出压力恒定,而流量随外界阻力变 化而变化。有机械注射式和机械往复式两种。每分 钟往复25~100次,脉动小。对流量变化敏感的检 测器也会有噪声干扰,此时可连接一脉动阻尼器。 ? 在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气 体,流动相先经过脱气装置再输送到色谱 柱,脱气不好时有气泡,导致流动相流速 不稳定,造成基线飘溢,噪音增加,也可采 用超声脱气和真空脱气 。 ? 梯度淋洗装置 在分离过程中通过不断地变化流动相的强度(极性、 pH值或离子强度 ),来调整混合样品中各组分的k值, 使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。 A B C C AB 2.进样装置 ? 1)隔膜注射进样:使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 ? 2)高压进样阀:目前最常用的为六通阀。由 于进样量可由样品管控制,因此进样准确,重 复性好。 3.色谱柱 一般直径2-6mm,柱长10-30cm, (尺寸排 阻色谱柱常大于5mm;制备色谱柱内径更大, 可达25mm以上)。 4.检测器 1)紫外检测器:适于吸收紫外光的物质。 2)示差折光检测器:利用折光率的差别, 灵敏度低,温度要求严格。 3)荧光检测器:只能分析自身发光的物质, 灵敏度高。 4)电化学检测器。 5)其它检测器:MS、IR、光散射、极谱。 紫外检测器 ? 其检测原理采用的吸收池为微 量吸收池,通常其光程为210mm,体积约为1~10 ?L ? HPLC分析中,约有80%的物 质可以在254nm或280nm处 产生紫外吸收。 ? 在选择测量波长时注意:溶剂 必须能让所选择的光透过,即 所选波长不能小于溶剂的最低 使用波长。 示差折光检测器: ? 原理:利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相,利用二者对光的折射率不同,其 中一束(通常是通过样品+溶剂相)光因为发 生偏转造成两束光的强度差发生变化,将此差 示信号放大并记录,该信号代表样品的浓度。 ? 为通用型检测器,灵敏度为10-7g/mL。但对 温度变化敏感,且不适于梯度淋洗。 荧光检测器 ? 许多有机物具荧光活性,尤其是芳香族化合物具有很 强的荧光活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器, 其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。 电导检测器 ? 电导检测器主要用于离子色谱的检测 ? 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电 导(电阻的倒数)变化来测量电离物质的含量。电导检 测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大,因 此需要将电导池置于恒温箱中。另外,当pH7时,该 检测器不够灵敏。 第四节 HPLC流动相和固定相简介 一、流动相 理想的溶剂应有下列特性: 1)避免使用引起柱效损失或保留特性变化的试剂。 2)与检测器相匹配。 3)高纯度:否则基线)适宜的粘度:粘度过高,柱压增加;过低,易产生气泡。 二、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体,因此,HPLC通 常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分: ? 刚性固体:SiO2为基质,耐压为7.0×108~1.0×109 Pa。可制成 直径、形状和孔隙深度不同的颗粒;主要用于吸附、分配和键 合色谱。 ? 硬 胶:以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成),耐 压上限为3.5×108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。 2. 按孔隙深度分: ? 表面多孔型:以实心玻璃珠为基体,在基体表面覆盖一层多孔 活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。 表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗 透性好,出峰快);但交换容量小。适于常规分离分析。 ? 全多孔型:全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成,因颗粒极细, 因而孔径小、传快、 柱效高。特别适于复杂混合物的分离。 第四节 HPLC主要类型 一、吸附色谱(adsorption chromatography) ? 原理:基于被测组分在固定相表面具有吸附作用, 且各组分的吸附能力不同,使组分在固定相中产生 保留和实现分离。 ? 固定相: 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、 聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂,所以吸附色谱也称 液固吸附色谱。活性硅胶最常用。 流动相: 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极 性溶剂的混合物,如正构烷烃(己烷、戊烷、 庚烷等)、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等 应用: 吸附色谱用于结构异构体分离和族分 离仍是最有效的方法,如农药异构体分离、石 油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不 对称峰和拖尾现象 二、分配色谱 ? 原理: 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解 度不同,因而具有不同的分配系数。 ? 流动相:HPLC分析中,为防止固定相的流失,流动 相与固定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差 越大越好。 根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液 色谱分为正相分配色谱(流动相极性小于固定相极 性,极性小的先流出,适于极性组分分离)和反相 分配色谱(流动相极性大于固定相极性,极性大的 先流出,适于非极性组分分离)。 固定相 ? 原则上,用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC 固定液易流失,因此常用的只有几种,按极性由高到低为:?, ?’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角 鲨烷(SQ)。 ? 根据涂渍方法的不同,可将固定相分为机械涂渍型和化学键合 型,后者应用更为广泛。 ? 1)机械涂渍固定相:将固定液通过机械混合的方法涂渍到表 面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上 形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流 失、分离稳定性及重现性差,不适合梯度淋洗。 为减少固定液的流失,通常在柱前加一根很短的前置柱,该柱 涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液,使流动相进入分析 柱之前,预先被固定液饱和。 2)化学键合固定相 ? 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在 载体表面所形成的柱填充剂,存在着双重分离机制: (键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率:分配为 主;低覆盖率:吸附为主;特点如下: 传质快,表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快 寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有机溶剂。 选择性好,可键合不同官能团,提高选择性,有利于梯 度洗脱。 Si-O-R:对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解,使酯链断裂, 因此只适于以不含水或醇的流动相。 Si-R(或Si-N):不水解,热稳定性比硅酸脂好。使用水溶液作流 动相时,其pH应在4-8之间。 Si-O-Si-R:不水解,热稳定性好,在pH2-8范围内对水稳定。 应用:液液色谱是基于化合物中取代基的数目或性质不同,或 化合物的相对分子量不同达到分离的。能分析各种不同性质的 样品,无论极性化合物还是非极性化合物 可见:反相键合色谱中,键合相碳链越长(极性越小),分离效 果越好 三、离子交换色谱 ? 1 原理:利用不同待测离子对固定相的亲和能力(或离子交换能 力)的差别来实现分离的。 ? 应用:适用无机离子混合物的分离,亦可用于有机物的分离,例 如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此,应用范围较广。 2 固定相:作为固定相的离子交换剂,其基质大致有 三大类:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶。而 离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基 的离解度大小还有强弱之分。 常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种: 多孔型离子交换树脂:它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联 聚合物,直径约为5~20μm,有微孔型和大孔型之分 薄膜型离子交换树脂:它是在直径约对30μm的固体惰性核上, 凝聚1~2μm厚的树脂层。 表面多孔型离子交换树脂:它是在固体惰性核上,覆盖一层微 球硅胶,再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。 ? 离子交换键合固定相:它是用化学反应将离子交 换基团键合到惰性载体表面 ? 它也分为两种类型。一种是键合薄壳型,其载体 是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型,它的载 体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换 固定相,它的优点是机械性能稳定,可使用小粒 度固定相和高柱压来实现快速分离 3 流动相 ? pH值:影响酸或碱的离解平衡,控制组分离子形式所占的分数。 当组分以分子形式存在时,则不被保留;离子分数越高,保留 值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水 等。 ? 离子强度I:对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相 中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将降低样品离子的竞 争吸附能力,使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐,可 影响柱的选择性,因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。 ? 有机溶剂:外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小, 保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环 已烷等。 ? 配离子L:当大量L、组分X随流动相进入柱后,发生配位剂交 换:RM-L+X?? RM-X+L,该法用于分离各种氨基酸或碱类。 四、离子色谱 ? 离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与 离子交换色谱原理一样,只是流出的各种离子用电导检 测器检测。但由于流动相都是强电解质,其电导率比待 测离子约高2个数量级,这种强背景电导会完全掩盖待 测离子信号。 ? 为解决此问题,1975年Small 提出,在离子交换柱之 后,再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相 反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱, 使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相, 从而可用电导检测器检测各种离子的含量。 ? 例如:分析阳离子时,以无机酸为流动相,抑制柱为 高容量的强碱性阴离子交换树脂,则发生下列反应: ? R+—OH + HCl(流动相)——R+—Cl- + H2O ? R+—OH + MCl(待测物) ——R+—Cl + M+OH- ? 由反应可见:经抑制柱后,一方面将大量酸转变为电 导很小的水,消除了流动相本底电导的影响。同时, 又将样品阳离子M+转变成相应的碱,由于OH-离子的 淌度为Cl-离子的2.6倍,提高了所测阳离子电导的检 测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理 ? 该法的不足之处在于: 抑制柱要定期再生、谱 峰在经过抑制柱后会展 宽,降低分离度。 ? 因此有人提出了使用电 导率很低的溶液(如苯甲 酸盐稀溶液)作流动相称 为非抑制型离子色谱或 单柱离子色谱 五、离子对色谱 ? 离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱 ? 原理:离子对色谱法是将一种(或数种)与溶质离子电 荷相反的离子(称对离子或反离子)加到流动相或固定 相中,使其与溶质离子结合形成离子对,从而控制溶质 离子保留行为的一种色谱法 例如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流 动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+: 由于离子对AB具有疏水性,因而被非极性固定相提 取。其它待测离子A1,A2,A3……..因与B离子间的 成对能力不同,而形成不同疏水性的离子对,使得各待 测物在柱内的保留值不同,从而达到分离的目的 ? 阴离子分离:常采用烷基铵类,如氢氧化四丁 基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子。 ? 阳离子分离:常采用烷基磺酸类,如己烷磺酸 钠作为对离子。 ? 反相离子对色谱:非极性的疏水固定相(C-18 柱),含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为 流动相,试样离子X-进入流动相后,生成疏水 性离子对Y+X-后;在两相间分配。 六、尺寸排阻色谱法 ? 尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法,主要用于较大分子 的分离。与其他液相色谱方法原理不同,它不具有吸 附、分配和离子交换作用机理,而是基于试样分子的 尺寸和形状不同来实现分离的。 ? 分离原理:固定相为化学惰性的多孔凝胶,它类似于 分子筛,但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴,分 子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻,较早地 被淋洗出来,中等的部分渗透,小分子则完全渗透, 最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大 小)先后从柱中流出。 尺寸排阻色谱的特点: ? (1)保留时间是分子尺寸的函数,有可能提供 分子结构的某些信息 ? (2)保留时间短,谱峰窄,易检测,可采用灵 敏度较低的检测器 ? (3)固定相与分子间作用力极弱,趋于零。由 于柱子不能很强保留分子,因此柱寿命长 ? (4)不能分辨分子大小相近的化合物,相对分 子质量差别必须大于10%才能得以分离 排阻色谱固定相 排阻色谱流动相 必须能溶解样品,并必须与凝胶本身非常相似,这样才能润湿 凝胶。当采用软性凝胶时,溶剂也必须能溶胀凝胶 另外,溶剂的粘度要小,因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作 用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离, 尤需注意 必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、 二甲基酸胺和水等 七、亲合色谱 ? 应用:主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合 力进行选择性分离及纯化的方法。 ? 分离原理:于载体表面先键合具有一般反应性能的环 氧或联氨(称为间隔臂),然后再连接上配基,如酶、 抗原或激素,当含有复杂混合试样的流动相流经这种 经固定化的配基时,其中具有亲合力特性的生物大分 子与配基相互作用而被保留,无此作用的则被洗出; 随后,改变流动相pH或组成,再将被保留的大分子组 分以纯品的形式洗脱出来。 ? 特点:选择性过滤、纯化效果好。 分子量 2000 2000 水溶性 可溶 不溶 不溶 可溶但不解离 可溶且不解离 可溶离子或非离子 方法 排阻色谱 排阻色谱 分配色谱(同系物) 吸附色谱(异构物) 排阻色谱(分子大小) 反相液液色谱 排阻色谱 阳离子交换色谱(碱) 阴离子交换色谱(酸) 反相离子色谱 流动相 水 水 各种 各种 各种 各种 水 缓冲液 缓冲液 缓冲液 第五节 HPLC的应用 ? 食品检验 ? 环境监测 ? 生命科学 ? 药物分析 ? 合成化学 ? 石油化学 ? 临床化学 ? 法学检验 ? 一. 在食品分析中的应用 1.食品营养成分分析:蛋白质、氨基酸、糖类、色素、 维生素、香料、有机酸(邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果 酸等)、有机胺、矿物质等; 2.食品添加剂分析:甜味剂、防腐剂、着色剂(合成 色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮 蓝等)、抗氧化剂等; ? 食品污染物分析:霉菌毒素(黄曲霉毒素、黄杆菌毒 素、大肠杆菌毒素等)、微量元素、多环芳烃等。 ? 二. 在环境分析中的应用 ? 多环芳烃(特别是稠环芳烃)、农药(如氨基甲酸 脂类,反相色谱)残留等 ? 三. 在生命科学中的应用 ? HPLC技术在生化领域的应用主要集中于两个方 面: 1. 低分子量物质,如氨基酸、有机酸、有机胺、 类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。 2. 高分子量物质,如多肽、核糖核酸、蛋白质和 酶(各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等) 的纯化、分离和测定。 ? 四. 在医学检验中的应用 体液中代谢物测定;药代动力学研究;临床药 物监测: 1. 合成药物:抗生素、抗忧郁药物(冬眠灵、 氯丙咪嗪、安定、利眠宁、等)、黄 胺类药等。 2. 天然药物生物碱(吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、 强心甙)等。


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